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介紹免疫沉淀CHIP的實驗步驟
更新時間：2020-12-28 點擊次數(shù)：3561次
免疫沉淀CHIP的原理是：在生理狀態(tài)下把細胞內的DNA與蛋白質交聯(lián)在一起，通過超聲或酶處理將染色質切為小片段后，利用抗原抗體的特異性識別反應，將與目的蛋白相結合的DNA片段沉淀下來。染色質免疫沉淀技術一般包括細胞固定，染色質斷裂，染色質免疫沉淀，交聯(lián)反應的逆轉，DNA的純化，以及DNA的鑒定。因為ChIP實驗涉及的步驟多，結果的重復性較低，所以對ChIP實驗過程的每一步都應設計相應的對照，而且對結果的分析也需要有一定的經(jīng)驗。對于剛剛開始使用ChIP技術的研究人員來說，使用成熟的商品化試劑盒和相關的技術服務會達到事半功倍的效果。
一、細胞固定
甲醛能有效的使蛋白質-蛋白質，蛋白質-DNA，蛋白質-RNA交聯(lián)，形成生物復合體，防止細胞內組分的重新分布。甲醛的交聯(lián)反應是*可逆的，便于在后續(xù)步驟中對DNA和蛋白質進行分析。交聯(lián)所用的甲醛終濃度為1%，交聯(lián)時間通常為5分鐘到1個小時，具體時間根據(jù)實驗而定。值得注意的是，交聯(lián)時間如果過長，細胞染色質難以用超聲波破碎，影響ChIP結果，而且實驗材料也容易在離心過程中丟失。交聯(lián)時間如果過短，則交聯(lián)不*，產生假陰性。甲醛的交聯(lián)反應可被加入的甘氨酸終止。
二、染色質斷裂
交聯(lián)后的染色質可被超聲波或MicrococcalNuclease切成400~600bp的片段（用瓊脂糖凝膠電泳檢測），以便暴露目標蛋白，利于抗體識別。超聲波是使用機械力斷裂染色質，容易引起升溫或產生泡沫，這都會引起蛋白質變性，進而影響ChIP的效率。所以在超聲波斷裂染色質時，要在冰上進行，且要設計時斷時續(xù)的超聲程序，保證低溫。另外，超聲探頭要盡量深入管中，但不接觸管底或側壁，以免產生泡沫。總超聲時間也不要太長，以免蛋白降解。
